一、简介：
盐、缓冲液以及其它小的离子是制备双向电泳样品时经常困扰科研人员的问题。由于这些杂质的存在，使电泳达到等电聚焦的时间延长，而且在第二向电泳时使凝胶上极端pH位置上的电泳结果扭曲，泳数造成电据丢失。
PIERCE为此专门研发出三个2-DE样品准备试剂盒（见表1）。
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表1，PIERCE的2-DE样品准备试剂盒
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试剂盒 |
适用的样品类型 |
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用于可溶蛋白的试剂盒 |
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全细胞和组织的蛋白提取物
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亲水性蛋白占大多数的样品 |
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用于核蛋白的试剂盒 |
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大的和/或疏水性蛋白
·
其它方法提取得到的核蛋白
·
蛋白聚集体或易形成蛋白聚集体的蛋白 |
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用于不溶蛋白的试剂盒 |
·
任何难溶性的蛋白
·
用作核蛋白抽提的哺乳动物细胞和组织 |
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二、原理：
PIERCE的2-DE样品准备试剂盒用脱盐/缓冲液置换的方法，清除样品溶液中的杂质，与常规的沉淀法和透析法相比，具有更快速、更方便和更可靠的优点。
PIERCE的2-DE样品准备试剂盒，采用了离心式蛋白质脱盐柱，可以在不到15分钟的时间内从细胞和组织提取物中去除≥98％的带电杂质；脱盐后，用2-DE样品准备试剂盒中的样品缓冲液平衡脱盐柱，这样既保持了蛋白质的溶解性，又促进了处理过程中蛋白质的回收率。而且，用2-DE样品准备试剂盒中的样品缓冲液重新溶解的蛋白质完全能够立即用于2-DE的第一向电泳固相化pH梯度（IPG）胶条上样，有效增加了允许上样量。
用PIERCE的2-DE样品准备试剂盒（表1）能处理大多数样品类型，用于核蛋白和不溶性蛋白的PIERCE的2-DE样品准备试剂盒有更严谨的2-D样品缓冲液，它所含的硫脲可以增加蛋白质的溶解性，促进2-DE的效果。
原理示意图(图1)：
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三、特点：
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去除小的带电杂质――有效缩短达到等电聚焦的时间，防止由于2-D电泳前沿盐离子存在所导致的电泳数据丢失
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蛋白质从缓冲溶液中置换到2-D样品缓冲液――保证蛋白质脱盐时始终可溶，而且用2-D样品缓冲液溶解的蛋白质可以直接上样到IPG胶条上，增加了有效上样量，相当于浓缩了蛋白质样品
·
处理过程更加快速――多种样品可以在不到15分钟内处理完，而不是常规的以沉淀或透析法为原理的商品化试剂盒所用的1个多小时
·
用于不溶或难溶的核蛋白的2-D样品缓冲液中含硫脲――硫脲能增加蛋白质溶解性，促进蛋白质在2-DE中的结果
四、使用方法：
1,提取蛋白质(全细胞提取物、膜蛋白和核蛋白)
2,蛋白质定量，用BCA蛋白质定量试剂盒（产品号#23225）
3,取出试剂盒提供的蛋白质2-D样品缓冲液
PIERCE用于可溶蛋白的2-D样品缓冲液中含有8M尿素和4%CHAPS
PIERCE用于不溶蛋白和核蛋白的2-D样品缓冲液中含有7M尿素，2M硫脲和4%CHAPS
4,用试剂盒提供的2-D样品缓冲液和离心式蛋白质脱盐柱（如图1示），进行蛋白质脱盐和缓冲液置换，约30ug的蛋白质样品加入2-D样品缓冲液至50ul终体积，洗涤离心处理，最后得到60ul洗提液，洗提液与125ul
2-D样品缓冲液混匀，并补50mM
DTT和0.4％
3/10或5/8
两性电解质。没处理的样品直接与2-D样品缓冲液、DTT及两性电解质混合。
5,上样，第一向电泳在11cm
pH4-7或pH5-8
IPG胶条上，第二向电泳用8-16%SDS-PAGE，电泳完后银染。用BCA蛋白质定量试剂盒（产品号#23225）测另一平行试验中的洗提后所得的蛋白质量。
五、结果和讨论
脱盐法和置换缓冲液法是准备2-DE样品的快速、高效的方法。
用该法得到的2-DE结果保留了原先由于盐离子存在而模糊的蛋白数据。如图2A和2B示。
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大于7K分子量的蛋白质，用2-D样品缓冲液处理得到的蛋白回收率高。从HeLa和NIH3T3细胞系的全细胞提取液中得到样品蛋白的回收率约为80%；从大鼠肝细胞裂解液以及从C6、HeLa和NIH
3T3细胞系的核蛋白提取液中，得到样品蛋白的回收率≥90%。
处理样品所需的时间非常短（如表2示），与沉淀和透析法相比，后二者所需的时间是PIERCE方法的6倍，效率也更低(如表3示）。
表2，IEF所需要的时间和IEF的pH
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核蛋白抽提物 |
HeLa全细胞裂解液 |
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脱盐/置换缓冲液法－IEF的时间（小时） |
5.25 |
5.25 |
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未处理的－IEF的时间（小时） |
6.5 |
6.75 |
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IEF的pH |
4-7 |
5-8 |
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表3，不同2-D样品准备方法所需时间的比较
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方
法 |
时间（分钟） |
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脱盐/置换缓冲液法 |
15 |
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沉淀法 |
90 |
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透析法 |
70 |
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而且，用商品化的以沉淀为原理的2-D样品准备试剂总得到一致性的结果：蛋白质溶解不完全，导致2-D电泳胶中部分数据模糊（图2C），透析法的效率也不高，核蛋白质用小于150mM
NaCl的缓冲液透析会出现沉淀。
2-D样品准备试剂盒不仅能去除带电微粒污染，而且可以有效浓缩蛋白样品。稀释的核蛋白抽提物（0.5mg/ml）用PIERCE的2-D样品准备试剂盒处理与未经处理的蛋白质作2-DE对照。未处理的蛋白抽提物的最大允许上样量为1倍体积，3倍体积抽提液经2-D样品准备试剂盒处理，再上样到11cm的IPG胶条。如图3示，经处理的样品浓度明显比未处理的高。
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图3.用脱盐/置换缓冲液法与未经处理的蛋白质样品最大上样量的2-DE银染结果比较，电泳条件：pH4-7
IPG、8-16%SDS-PAGE
A.
核蛋白用脱盐/置换缓冲液法，约27ug蛋白（约是B样品体积的三倍），置换到2-D样品缓冲液后2-DE
B.
未经处理的核蛋白，约9ug蛋白，最大上样体积
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图4.分别用可溶蛋白和不可溶性蛋白2-D样品准备试剂盒处理了的膜蛋白的2-DE银染结果比较，电泳条件：pH5-8
IPG、8-16%SDS-PAGE
A.
不可溶蛋白2-D样品准备试剂处理的样品，约35ug蛋白置换到7M尿素、2M硫脲，4%CHAPS
B.
可溶蛋白2-D样品准备试剂处理的样品，约35ug蛋白置换到8M尿素、4%CHAP |
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在处理膜蛋白时，用于不溶蛋白的2-D样品准备试剂盒效率高于用于可溶蛋白的2-D样品准备试剂盒。如图4示。说明硫脲有助于疏水蛋白溶解。
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货号 |
品
名 |
包装 |
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89863 |
2-D Sample Prep for Nuclear Proteins
包括：Cytoplasmic
Extraction Reagent I(CER I)
Cytoplasmic Extraction Reagent
II(CER II)
Nuclear Extraction Reagent(NER)
Protein Desalting Spin Columns
2-D Sample Buffer for Nuclear
Proteins
Component A
Component B |
Kit
5ml
0.275ml
2.5ml
25 columns
18ml
16.5g |
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89865 |
2-D Sample Prep for Soluble Proteins
包括：2-D
Sample Buffer for Soluble Proteins
Component A
Component B
Protein Desalting Spin Columns |
Kit
19.5ml
15g
25 columns
|
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89866 |
2-D Sample Prep for Insoluble
Proteins
包括：2-D
Sample Buffer for Insoluble Proteins
Component A
Component B
Protein Desalting Spin Columns |
Kit
18ml
16.5g
25 columns
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2-D蛋白质分子量Marker
含7种已知pI的、已经变性好的蛋白质，分子量范围从17K至80K，pI从4.5-8.7，详细组分见下表：
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2-D Marker
蛋白 |
分子量 |
pI值 |
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Apo-transferrin (human plasma) |
80K |
6.2 |
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Glutamic Dehydrogenase (bovine
liver) |
56K |
6.5,6.7,6.9 |
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Actin (bovine muscle) |
43K |
5.2 |
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Carbonic Anhydrase (bovine
erythrocytes) |
29K |
6.3 |
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Myokinase (chicken muscle) |
22.5K |
8.7 |
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Trypsin Inhibitor(soybean) |
20K |
4.5 |
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Myoglobin (equine skeletal muscle) |
17K |
7.0,7.4 |
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2-D蛋白质分子量Marker在2-D电泳后经过银染（左）和考马斯兰染色（右）后图
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A. Human Apo-transferrin
B. Bovine Glutamic Dehydrogenase
C. Bovine muscle Actin
D. Bovine Carbonic Anhydrase |
E. Chicken Myokinase
F. Soybean Trypsin Inhibitor
G. Equine Myoglobin |
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根据胶的大小和染色方法，500ul的2-D蛋白质分子量Marker足够使用的次数：
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胶的大小 |
染色方法 |
建议每次使用的Marker体积 |
可使用的次数 |
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Mini-Gels |
考马斯兰 |
2.5ul |
200 |
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Mini-Gels |
银染 |
0.5-1.0ul |
500-1000 |
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Large Format Gels |
考马斯兰 |
5-7.5ul |
66-100 |
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Large Format Gels |
银染 |
1.0-2.5ul |
200-500 |
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货号 |
品
名 |
包装 |
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26659 |
2-D Protein Molecular Weight Marker
Mix |
500ul |
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2、PAGEprep®
蛋白质上样前脱杂质和浓缩试剂盒
几分钟的工作，就可使您得到更好的PAGE条带，使您的结果锦上添花
简介：可以高效去除蛋白质溶液中的盐酸胍、硫酸铵及酸性缓冲液等与常规PAGE电极缓冲液不相容的杂质，同时，有效浓缩蛋白质，在不到10分钟内处理完就可以直接电泳上样。比常规透析法、超滤法高效、简单、快速。
原理：EP离心管中，在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，20ul的胶可以与20ug以上的蛋白质结合，原蛋白质缓冲液被离心洗去，再用50ul洗涤/上样缓冲液洗出蛋白，上样。
适用的蛋白质样品：
（1）
溶解在盐酸胍中的包涵体蛋白
（2）
含酸性缓冲液、硫氰酸盐或尿素等柱层析成分的蛋白质
（3）
硫酸铵沉淀的蛋白质
（4）
稀释的蛋白质溶液
几种准备样品方法的比较
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PAGEprep® Kit |
透析 |
超滤 |
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样品体积 |
200ul |
200ul |
200ul |
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蛋白质回收率 |
70-85% |
70-90% |
70-90% |
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所需时间 |
<10m |
20m-10h |
30-120m |
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是否浓缩 |
是 |
否 |
是 |
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M:膜蛋白，S：亲水蛋白
未经处理的和经PAGEprep®Kit处理的膜蛋白和亲水性蛋白的Western图（用SuperSignal化学发光底物显色），显示经处理后的效果好于未处理的。
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含盐酸胍的蛋白质缓冲溶液，从图中可见，经PAGEprep®Kit处理的蛋白未出现沉淀 |
1, TriChromRange™预染的蛋白质分子量Marker（产品号#26691）；
2. 10ul 0.1mg/ml BSA；
3. 10ul 0.1mg/ml BSA经PAGEprep®Kit处理后上样
4. 200ul 0.1mg/ml BSA经PAGEprep®Kit处理后上样 |
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货号 |
品
名 |
包装 |
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26800 |
PAGEprep® Protein
Clean-Up and Enrichment Kit
足够处理50次蛋白样品
包括：含修饰过的硅藻土胶液（50%）
洗涤/上样缓冲液
纯DMSO |
Kit
1ml
2.5ml
25ml |
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3. SwellGel®
Blue 白蛋白去除试剂盒
15分钟内去除血清中的白蛋白
简介：人血清白蛋白（HAS）在血清样品总蛋白中占>60%，约40mg/ml，严重妨碍了样品蛋白的研究分析，例如：双向电泳。而传统的去除方法烦琐、费时，为此，PIERCE专门研发出SwellGel®
Blue
白蛋白去除试剂盒。它能方便、高效去除血清等样品中的白蛋白，又不引入新的杂质，可以同时操作多个样品。经过优化，本试剂盒提供的方法适用于去除人、猪、羊、牛、山羊和大鼠血清中的白蛋白，而不适合于去除小鼠血清白蛋白。每个SwellGel?
Blue disc的HAS吸附能力>2mg。
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用SwellGel®
Blue
白蛋白去除试剂盒对人血清处理前后作2-D电泳分析，示意图如下（A：未去除白蛋白的；B：已去除白蛋白的）：
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订货信息：
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货号 |
品
名 |
包装 |
|
89845 |
SwellGel®
Blue Albumin Removal Kit
包括：SwellGel®
Blue Albumin Removal Discs
Binding/Wash
Buffer
Handee™
Mini-Spin
Columns |
Kit
25
discs
6.25ml
25
columns
|
|
89846 |
SwellGel®
Blue Albumin Removal Kit
包括：SwellGel®
Blue Albumin Removal Discs
Binding/Wash Buffer
Handee™
Mini-Spin
Columns |
Kit
100
discs
25ml
50
columns
|
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